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2020-10
下呼吸道感染是臨床最常見的感染性疾病之一， 具有很高的病死率。根據(jù)世界衛(wèi)生組織 （ＷＨＯ）2018年公布的2016年統(tǒng)計數(shù)據(jù)，全球前十位死亡原因中下呼吸道感染高居第四位，在傳染性疾病中位列第一，共導致約300萬人死亡。
2002年非典型肺炎（SARS），2003年新型H1N1甲型流感，2013年H7N9流感病毒，以及2019年新型冠狀病毒（2019-nCoV）疫情爆發(fā)，對人類的生命健康造成嚴重威脅。可見，呼吸道感染對人類健康的威脅有不斷增加的趨勢。
呼吸道感染病原早期診斷對于迅速有效控制急性呼吸道感染發(fā)揮著至關(guān)重要作用！
由于各種呼吸道病毒感染的臨床癥狀相似，醫(yī)生難以簡單地通過體征做出病原學診斷。
為了及時控制病情，臨床上常常采取經(jīng)驗性用藥，待得到培養(yǎng)結(jié)果及藥敏測試結(jié)果后再進行調(diào)整。但這也容易導致抗菌藥物使用不當，使病原微生物耐藥性出現(xiàn)及蔓延的概率增加，導致下呼吸道感染的診斷和治療更為棘手，成為當今全球共同面臨的重大衛(wèi)生挑戰(zhàn)。因此，開發(fā)新的、更準確及高通量的下呼吸道感染病原微生物檢測方法具有重要意義。
近些年來，出現(xiàn)了改良細胞培養(yǎng)法分離并鑒定病毒，使其滿足臨床診斷的要求。不同的細胞種類對病毒敏感程度不同，接種未知標本就要選用多種不同的細胞系，工作量大，不利于臨床實驗室操作。因此出現(xiàn)了將不同種類的細胞混合起來制備成單層細胞的方法，可提高檢測靈敏度。R-Mix是水貂肺細胞和A549的混合細胞，用來檢測呼吸道合胞病毒（RSV）、副流感病毒（PIV）、流感病毒及腺病毒（ADV）。而隨著病毒特異性單克隆抗體的出現(xiàn)，可在產(chǎn)生CPE之前對病毒進行鑒定，縮短病毒檢測的時間。這些方法雖經(jīng)改良，但細胞培養(yǎng)操作耗時、敏感性低、技術(shù)要求高的問題未得到根本解決，因此在國內(nèi)仍未能得到廣泛應用。
直接免疫熒光法是目前臨床最為常用的快速診斷方法之一。該方法使用熒光素標記的抗病毒單克隆抗體檢測呼吸道上皮細胞中的病毒抗原，大約2h就能判斷結(jié)果。但該方法的檢測結(jié)果受樣本的質(zhì)量和處理過程影響較大，要求標本中有一定量的呼吸道上皮細胞，否則會造成假陰性的結(jié)果。
膠體金免疫層析法利用免疫層析的原理，通過抗原抗體結(jié)合，以膠體金為示蹤物呈現(xiàn)顏色反應，從而判斷樣本中是否存在檢測的抗原或抗體。該檢測方法具有特異性強、操作簡單、重復性好、方便快捷（一般能在10～30min獲得結(jié)果）且不需要特殊設(shè)備和儀器等優(yōu)點，因而非常適合臨床早期診斷和出入境等機構(gòu)的現(xiàn)場篩查，但是其敏感性低于實時熒光定量聚合酶鏈反應（Realtime RT-PCR），該檢測方法的結(jié)果僅能作為初步參考。
呼吸道病毒感染是臨床最常見的疾病之 一，病原學復雜，準確的病原學診斷是合理選擇治療方案的基礎(chǔ)。
核酸檢測法是檢測病毒保守特異的核酸序列，可將病毒鑒定到種。臨床實驗室中應用最廣泛的是PCR技術(shù)，利用互補引物特異性指數(shù)擴增病毒基因組中的片段?；赑CR技術(shù)及其衍生的熒光PCR和多重PCR技術(shù)，對病毒核酸檢測靈敏度和特異性均較高（比傳統(tǒng)病毒培養(yǎng)方法敏感3.8倍左右），但實驗條件要求嚴格，單次檢測種類有限，且成本較高。另外，有些病毒一旦感染后就會永久寄生在宿主體內(nèi)，病毒核酸檢測過于敏感，即使擴增結(jié)果陽性未必代表患者處在某種病毒的急性感染期。
病原微生物宏基因組檢測法（mNGS）
宏基因組學（Metagenomics）也叫微生物環(huán)境基因組學。通過直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的DNA,構(gòu)建宏基因組文庫，利用基因組學的研究策略研究環(huán)境樣品所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能。它是在微生物基因組學的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種研究微生物多樣性、開發(fā)新的生理活性物質(zhì)（或獲得新基因）的新理念和新方法。
宏基因組二代測序，英文為“Metagenomics Next Generation Sequencing”,即mNGS，利用高通量測序，對樣本中的核酸進行測序，可一次并行獲取標本中的人源核酸序列信息和外源病原微生物核酸序列信息，將獲得的序列與人類基因組序列庫和病原體微生物基因組序列庫進行比對注釋，即可實現(xiàn)病原微生物的鑒定。
宏基因組檢測覆蓋已知的所有病原，對感染標本直接進行檢測，無需預設(shè)，直接檢測。包括細菌、真菌、病毒、寄生蟲，以及支原體等，都可以“一網(wǎng)打盡”，為臨床中呼吸道感染提供快速精準診斷依據(jù)。
宏基因組測序和傳統(tǒng)檢測方法學在病原檢測方面的時效性比較示意圖：
（病毒在多種方法學中的檢測中時效性的對比）
膠體金免疫層析法：第3-7天；流式細胞法：第1-10天；傳統(tǒng)免疫熒光法：第1-10天；核酸檢測法：第0.5-20天；血清IgM：第5天后；IgG檢測法：第15天后；mNGS法：1-2天。
總結(jié)：
通過分析比較，傳統(tǒng)的培養(yǎng)法雖然是檢測下呼吸道感染病原體的“金標準”，但通常需要2-4ｄ甚至更長時間?？乖椒z測結(jié)果對樣本的質(zhì)量要求高，否則容易造成假陰性的結(jié)果。血清學方法存在通量低，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果等缺陷。核酸檢測方法雖然是目前最快速的選擇，但其單次檢測種類有限。目前宏基因組病原體檢測優(yōu)勢明顯，具有快速檢測、全面覆蓋、準確性高等優(yōu)勢，適合于呼吸道感染的各個階段，尤其是對早期診斷意義重大，已經(jīng)逐步成為病毒診斷技術(shù)的發(fā)展趨勢。
呼吸道感染臨床早期診斷有利于避免抗生素的濫用，根據(jù)病原體的不同正確地進行抗病毒治療；有利于降低院內(nèi)傳播風險；有利于開展個體化診療以降低患者整體治療費用；并為早期預防和治療提供病原學的有力支撐和實驗室的明確診斷。
參考文獻：
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